Ngày đăng: 05/05/2019, 20:10

Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày trở nên cấp thiết, giải trình cho thấy phần nhiều vụ ngộ độc thực phẩm vi con vật Đã có nhiều thông báo, thực trạng ngộ độc thực phẩm leo thang ngày cực kỳ nghiêm trọng Có nhiều vi con vật gây ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn Clostridium butolinum, Escherichia Coli, Listeria monocytogenes… đó, Salmonella lồi vi con vật gây ngộ độc bất trắc Salmonella thuộc họ Enterobactriaceae, gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết nhiều bệnh cực kỳ nghiêm trọng khác Khởi đầu từ nhu cầu tìm tòi độc tố, khả gây bệnh cách phát cách phòng phòng chống bệnh vi khuẩn Salmonella,tơi thực phân tích chủ đề “tìm hiểu vi khuẩn Salmonella” để có nhìn khái quát vi khuẩn Salmonella số chủng vi con vật khác 1.2 Mục đích – Khái quát số loại vi con vật thường lây nhiễm vào thực phẩm tìm tòi Salmonella với độc tố 1.3 Bài viết phân tích – Phân tích dấu hiệu sinh hóa, sinh lý, kháng nguyên, độc tố chế gây độc số chủng vi con vật – Phân tích cách phát Salmonella đề nghị phương pháp phòng ngừa GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Khái quát số vi con vật nhiễm thực phẩm 2.1.1 Escherichia Coli 2.1.1.1 Giới thiệu – Escherichia Coli Theodore Escherich (1857 – 1911), bác sỹ nhi khoa người Áo phát năm 1885 – E.Coli member hệ vi khuẩn bình bình đường tiêu hóa, nguyên nhiều bệnh nhiễm trùng – E.Coli sử dụng làm mơ hình phân tích sinh học phân tử ngành nghề vi sinh học nói riêng sinh học nói chung Trong số đó, chủng E.coli K12 mơ hình phân tích nhiều Nhiều thành quả di truyền học, hóa sinh học thu dựa sở phân tích vi khuẩn 2.1.1.2 Phân loại – Về phân loại, Escherichia Coli xếp vào:  Giới: Bacteria  Nghề: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Escherichia  Loài: Escherichia Coli 2.1.1.3 Dấu hiệu – E.Coli trực khuẩn, Gram âm, kích cỡ bình quân t àm ì 0,5 àm Mt s chủng E.Coli có vỏ, chủ yếu có lơng có khả di động – E.Coli có khả lên men nhiều loại đường có khả sinh E.Coli có khả sinh Indol, khơng sinh H2S, không sử dụng nguồn carbon citrat mơi trường Simmons, có deoxycarboxylase nên có khả phân giải carborxyl lysin, ornithin, arginin acid glutamic Thực nghiệm VP (Voges – Proskauer) sau 24h âm tính, sau 48h dương tính GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella 2.1.1.4 Hình 2.1 : Vi khuẩn Escherichia Coli Yếu tố độc lực – Người ta chia E.coli thành nhiều nhóm, nhóm sinh loại độc tố khác nhau, có nhóm : STEC (Shiga toxin-producing E.Coli) VTEC (Verotoxigenic E.Coli) EHEC (Enterohaemorrhagic E.Coli), EPEC (Enteropathogenic E.Coli), ETEC (Enterotoxigenic E.Coli), EAEC (Enteroaggregative E.Coli) EIEC (Enteroinvasive E.Coli) a) Nhóm STEC – Hiện có nhiều thuật ngữ khác để gọi tên cho nhóm E.Coli Cái tên Verotoxigenic E.Coli (VTEC) Konowalchuk hợp tác viên (1977) đặt cho nhóm phát việc sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào Vero Cái tên Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) dòng gây viêm kết tràng xuất huyết triệu chứng huyết niệu (Nataro Kaper, 1989) & thuật ngữ Shiga toxin-producing E.Coli (STEC) (trước gọi Shiga-like toxin producing E.Coli SLTEC) rõ khả sản sinh độc tố gây độc tế bào giống độc tố Shiga – STEC sản xuất độc tố Shiga-like toxin (Slt), gọi Shiga toxin (Stx) hay Verotoxin (VT) Họ độc tố Stx gồm hai nhóm không phản ứng chéo với Stx1 Stx2 Trong Stx1 có tính bảo tồn cao Stx2 biến đổi trình tự, tạo nhiều subtype Stx2c, Stx2hb, Stx2e, Stx2g Một dòng STEC sản sinh Stx1, Stx2 Stx1 Stx2, chí nhiều dạng Stx2 – Hai độc tố Stx1 Stx2 kết cấu từ tiểu nhà cung cấp B có khối lượng phân tử 7,7 kDa tiểu nhà cung cấp A có khối lượng phân tử 32 kDa Tiểu nhà cung cấp A gồm peptide A1 28 kDa peptide A2 kDa nối với điểm kết nối disulfur Peptide A1 có hoạt tính enzyme peptide A2 có trách nhiệm bền chặt tiểu nhà cung cấp A vào tiểu nhà cung cấp B Những tiểu nhà cung cấp B giúp độc tố kết phù hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) diện mặt phẳng tế bào eukaryote (Stx2e có receptor Gb4) Sau chuyển vào bên tế bào, tiểu nhà cung cấp A đến tế bào chất ảnh hưởng lên tiểu phần 60S ribosome Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động N-glycosidase cắt gốc adenin khỏi rRNA 28S ribosome, gây chướng ngại cho thống kê protein Do không thống kê protein, tế bào bị Stx ảnh hưởng (tế bào nội mô thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Hela hay tế bào có receptor Gb3, receptor Gb4 Stx2e) chết Hậu gây độc cho tế bào ruột Stx yếu tố độc lực khác STEC gây hỏng hóc tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy viêm kết tràng xuất huyết (Haemorrhagic colitis – HC) Sự hỏng hóc tế bào thành huyết mạch Stx2e gây nên tượng phù thủng heo – Yếu tố bám dính STEC/EHEC minh chứng đóng vai trò trọng yếu định vị vi khuẩn ruột Đó intimin, protein màng ngồi có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa Intimin mã hóa gen eae (E.Coli attaching and effacing) Intimin gây thương tổn dạng bám dính tàn phá (attachingand-effacing, A/E) ruột già vi khuẩn bám chắc vào tế bào biểu mô (Donnerberg cộng tác viên, 1993) Gen eae tìm ra nhóm EPEC Gen eae gây thương tổn kiểu A/E số gen nằm vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi vùng gây hỏng hóc tế bào ruột – locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE STEC/EHEC chứa gen mã hóa cho intimin, mã hóa receptor intimin Tir (translocated intimin receptor) số gen khác Vùng LEE không điều kiện cần mà điều kiện đủ cho việc tạo dựng thương tổn A/E Bên cạnh đó khơng phải tất STEC có gen eae, tất EHEC có gen eae – Yếu tố khác có liên quan đến độc lực STEC việc tạo enterohaemolysin (EHEC-Hly) độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (enteroaggregative heat – stabe toxin – 1) EHEC-Hly mã hóa gen plasmid 60 MDa (pO157) mà plasmid tìm ra gần tất dòng O157:H7 thông dụng dòng STEC non-O157 (Nataro Kaper, 1998) Trên plasmid có diện operon gồm khung đọc mở (open reading frame ORF) hlyCABD Trong hlyA gen cấu tạo bắt đầu cho haemolysin Độc tố ruột chịu nhiệt EAST1 (trước nhất mơ tả nhóm EAEC EAEC heat-stable enterotoxin 1), tìm ra nhiều dòng STEC Tầm trọng yếu EAST1 khả gây bệnh STEC chưa biết, có vài trường hợp tiêu chảy khơng có máu mà thường thấy người nhiễm STEC b) Nhóm EPEC GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Các yếu tố độc lực bao gồm gen eae mã hóa protein itimin thiết yếu cho việc tạo thương tổn dạng A/E, plasmid 50 – 70 Mda ( EAF ) : mã hóa BFP (bundle – forming pilus), PER (plasmid – encoded regulator) Ler (LEE – encorded regulator) Các protein tiết : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG MAP ( mitochondria – associated protein), EAST – có khả tàn phá tế bào biểu mô CDT (Cytolethan distending toxin) c) Nhóm ETEC – Nhóm ETEC có hai nhóm định độc lực độc tố ruột (enterotoxin) yếu tố định vị (colonization factor – CF) – Độc tố ruột enterotoxin + Nhóm ETEC gồm E.Coli tạo hai loại độc tố đường tiêu hóa ST LT ETEC gây bệnh cách vi khuẩn bám vào mặt phẳng màng nhầy ruột non tiết độc tố ruột, làm tăng trưởng thực trạng tiết dịch Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua tiết độc tố đường tiêu hóa LT ST E.Coli nhóm tiết độc tố LT, tiết ST, tiết LT ST  Độc tố không chịu nhiệt (Heat-labile toxin – LT): Độc tố LT E.Coli oligopeptide có liên hệ thân thiện mặt cấu tạo chức với độc tố tả (cholera toxin – CT) Vibrio cholerae tiết LT CT giống nhiều đặc điểm cấu tạo, trình tự acid amin (giống khoảng 80%), tương đồng receptor, hoạt tính enzym, ảnh hưởng thú hay ni cấy tế bào  LT có serogroup LT-I LT-II LT-I LT-II khơng có phản ứng chéo mặt miễn dịch LT-I tiết dòng E coli gây bệnh người thú Còn LTII tìm ra chủ đạo E coli thú người LT-I oligopeptide khoảng 86 kDa, kết cấu tiểu nhà cung cấp A 28 kDa tiểu nhà cung cấp B 11,5 kDa Tiểu nhà cung cấp A chịu nhiệm vụ hoạt tính enzyme độc tố gồm peptide A1 peptide A2 link điểm kết nối disulfur Những tiểu nhà cung cấp B xếp thành vòng, link chắn với ganglioside GM1 link lỏng lẻo với GD1b vài glycoprotein ruột – chúng receptor LT Hai loại LT-I có liên hệ gần phản ứng chéo phần với LTp (LTp-I) phân lập từ heo LTh (LTh-I) phân lập từ người Gen mã hóa cho LT elt hay lt-I nằm plasmid mà plasmid chứa gen mã hóa GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella ST &/hoặc gen mã hóa kháng nguyên yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA)  Sau độc tố vào nội bào, chúng di chuyển tế bào nhờ hệ thống vận tải Golgi Đích đến LT tế bào enzym adenylate cyclase nằm lớp màng tế bào biểu mơ ruột Peptide A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein link GTP (GTP-binding protein) GS, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng trưởng AMP vòng (cAMP) tế bào Vì enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) họat hóa kéo theo phosphoryl hóa kênh chloride (Cl-) màng tế bào biểu mơ vượt q mức bình bình Kết dây chuyền kích thích tế bào bên tiết Cl- ngăn cản hấp thụ NaCl tế bào có lơng nhung Hàm lượng ion lòng ruột tăng trưởng dẫn theo di chuyển bị động nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (Nataro Kaper, 1998) Mặc dầu kích thích Cl – tăng trưởng lượng cAMP tế bào cách giải thích cổ kính chế gây tiêu chảy LT CT, ngày có nhiều chứng cho thấy thỏa mãn tăng tiết độc tố có chế cầu kỳ Một chế ảnh hưởng khác độc tố có liên quan đến prostaglandin E (PGE1 PGE2) yếu tố hoạt hóa tiểu cầu Sự thống kê phóng thích chất chuyển đổi acid arachidonic prostaglandin leukotriene kích thích vận tải chất điện giải kích thích nhu động ruột Chế độ ảnh hưởng khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system – ENS) điều hòa nhu động tiết ion ruột Chế độ thứ ba CT LT gây thỏa mãn viêm ruột dạng nhẹ  Nhóm LT-II giống với LT-I CT khoảng 55 – 57% tiểu nhà cung cấp A, không giống với LT-I CT tiểu nhà cung cấp B LT-II làm tăng trưởng cAMP tế bào qua chế tương đương LT-I, LT-II sử dụng GD1 làm receptor thay GM1 Như nói trên, LT-II khơng có liên quan đến bệnh người thú  Độc tố chịu nhiệt (Heat-stable toxin – ST): Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ điểm kết nối disulfur giải thích cho khả chịu nhiệt độc tố ST chia thành nhóm STa STb, khác cấu tạo chế hoạt động Gen mã hóa cho nhóm tìm ra chủ đạo GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella plasmid vài gen mã hóa ST tìm ra transposon Sta (hay gọi ST-I) tạo ETEC vài vi khuẩn Gram âm khác Yersinia enterocolitica V cholerae non – O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 EAEC Gần đây, có giải trình cho vài dòng ETEC sản sinh độc tố EAST1 ngồi độc tố STa Còn STb tìm ra ETEC  STa peptide gồm 18 -19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng kDa STa chia thành loại STp (ST porcine hay STIa) phân lập heo STh (ST human hay STIb) phân lập người Cả loại độc tố tìm ra dòng ETEC người Receptor STa enzyme xuyên màng GCC (guanylate cyclase C) thuộc họ enzyme receptor cyclase Sự phối hợp STa vào GC-C kích thích hoạt tính GC, kéo theo việc tăng trưởng lượng cGMP nội bào Hoạt động cuối kéo theo kích thích tiết Cl – ngăn cản hấp thụ NaCl, gây tiết chất lỏng ruột STb: STb chủ đạo có liên quan đến dòng ETEC phân lập từ heo có giải trình vài chủng ETEC người sản sinh STb Không STa, STb gây thương tổn mặt mô học lớp biểu mô ruột tế bào nhung mao biểu mô ruột teo nhung mao phần Receptor STb chưa biết rõ gần người ta cho độc tố phối hợp khơng đặc hiệu với màng tế bào chất trước vào tế bào Không tạo tiết Cl – STa, STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO 3-) STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào STb kích thích phóng thích PGE2 serotonin, từ người ta cho ENS có liên quan đến thỏa mãn tiết gây độc tố (Hitotsubashi, 1992) – Yếu tố định vị (CF): Chế độ mà ETEC kết dính cư trú lớp màng nhầy ruột phân tích kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông mặt phẳng vi khuẩn, gọi yếu tố định vị (CF) CFA phân loại dựa đặc điểm hình thái Có loại gồm loại lơng hình que cứng, lơng hình que mềm có dạng bó, lơng có cấu tạo mảnh mềm Gen CFA thường mã hóa plasmid, nơi mã hóa cho độc tố ST &/hoặc LT d) Nhóm EAEC GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Những yếu tố độc lực EAEC bao gồm diềm bám dính kết tập AAF (aggregative adhesion fimbriae), yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, protein Pet độc tố EAST – AFF xem yếu tố định độc lực Ba loại AAF nghe đến gồm AAF/I, AAF/II AAF/III, loại I loại II có cấu tạo bó, loại III có cấu tạo dạng sợi tách biệt Các AAF tạo thành kiểu bám dính hình chồng gạch lên tế bào Hep – Yếu tố aggR có vai trò điều hòa biểu AAF Protein Pet tiết màng vi khuẩn gây tụ dịch gây độc cho biểu mơ tiêu hóa EAST – có khả tàn phá tế bào biểu mơ Ngồi yếu tố độc lực nêu trên, EAEC tiết protein làm tan máu làm thăng vận tải protein qua màng Các yếu tố độc lực nêu EAEC chủ đạo mã hóa gen nằm plasmid có phân tử lượng 60 MDa Một số yếu tố độc lực mã hóa gen nhiễm sắc thể phân tích e) Nhóm EIEC – EIEC gây bệnh chủ đạo khả xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Khả xâm nhập mã hóa gen plasmid 140 MDa Các gen plasmid mã hóa cho kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa: Invasion plasmid antigen) EIEC có khả sản xuất độc ruột giống số Shigella Gen mã hóa cho độc tố có tên sen (Shigella enterotoxin), chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ EIEC xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, làm tiêu túi thực bào nhân lên bào tương, tàn phá tế bào xâm lấn sang tế bào khác 2.1.1.5 Khả gây bệnh – E.Coli lý do gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật Là lý do gây bệnh nhiễm khuẩn huyết, nguyên thường gặp bệnh viêm màng não, viêm phổi trẻ sinh E.Coli gặp nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng bỏng – Trong loại độc tố E.Coli, độc tố Shiga bất trắc nghe đến người, làm tàn phá vi nhung mao hấp thu tế bào biểu mơ ruột Nó xâm nhập vào tế bào biểu mơ đại tràng, ức chế q trình thống kê protein làm chết tế bào Hậu gây viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân máu Những trường hợp họai tử nặng gây thủng ruột 2.1.1.6 Các thực phẩm liên quan GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Các trọng tâm kiểm sốt bệnh dịch (CDC) tính có 85% nguồn gốc E.Coli có nguồn gốc thực phẩm Trên thực tiễn, tiêu thụ thực phẩm nhiễm phân (đặc biệt phân gia súc) kéo theo việc nhiễm bệnh Các thực phẩm xác nhận nguồn gây bệnh bao gồm thịt bò xay, thịt nai, xúc xích sấy khơ (khơng hấp cho chín), sữa chưa tiệt trùng, phô mai, nước trái chưa tiệt trùng, cỏ linh lăng, mầm củ cải, rau nước 2.1.1.7 Bí quyết phòng ngừa kiểm sốt – Hiện chưa có phương pháp phòng ngừa đặc hiệu Để dự phòng nhiễm khẩn đường ruột E.Coli, thực phương pháp phòng ngừa khơng đặc hiệu giống loại vi khuẩn đường tiêu hóa khác – Dự phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu E.Coli : thực sinh hậu mơn phận sinh dục ngồi Điều trị ngoại trừ yếu tố nguy khác E.Coli vi khuẩn gây bệnh hội trọng yếu 2.1.2 Listeria monocytogenes 2.1.2.1 Giới thiệu – Năm 1924, Muray cộng trình phân tích bệnh dịch động vật thử nghiệm, phân lập chủng vi con vật từ hạch lympho động vật bị bệnh Sau ông lấy chủng vi khuẩn tiêm cho vật mạnh khỏe thấy có tượng tăng bạch cầu đơn nhân (monocytosis), ơng đặ tên cho Bacillus monocytogenes Ba năm sau, Nam Phi, Pirie, phân tích đưa Yersinina pestis chuột, phân lập từ gan chuột chủng vi khuẩn đặt tên cho Listeria hepatolitica Loại vi khuẩn hồn tồn khơng thể phân biệt với chủng vi khuẩn Muray Chính vậy, Pirie đề nghị tên cho chủng vi khuẩn này, Listeria monocytogenes 2.1.2.2 Phân loại  Giới: Bacteria  Nghề : Firmicutes  Lớp: Bacilli  Bộ: Bacillales  Họ: Listeriaceae  Chi: Listeria  Loài : Listeria monocytogenes 2.1.2.3 Dấu hiệu – Các lồi Listeria trực khuẩn Gram dương, có kích cỡ ngn (0,4 0,5 ì 0,5 2,0 àm), chỳng mọc môi trường nuôi cấy không acid, không sinh GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella nha bào Ở 20oC chúng di chuyển lông mọc xoay quang thân (peritrichous flagella), di động không xem xét 37 oC Chúng vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc sinh trưởng khoảng nhiệt độ dao động rộng từ – 45oC (tối ưu 30 – 36oC), vận tốc mọc nhiệt độ thấp chậm Chúng mọc khoảng pH dao động rộng, số chủng mọc pH 9,6, đạt điều kiện tối ưu pH kiềm mơi trường trung tính Hình 2.2: Vi khuẩn Listeria monocytomonogenes 2.1.2.4 Yếu tố độc lực – Listeriolysin O (LLO) yếu tố độc lực Listeria monocytigenes cho phép khỏi thực bào LLO có khối lượng phân tử 58,6 kDa, tạo dựng chuỗi polypeptide đơn gồm 529 amino acids Trình tự đầu N đại diện cho dấu hiệu trình tự biểu hiện vi khuẩn Gram dương điển hình: phần có tính nước đưa điện tích dương theo sau 20 đầu kỵ nước Trình tự mã hóa trực tiếp cho protein phân cắt sau địa điểm lysine 25 Kết LLO amino acid 26, phân tử protein dài 504 aa có trọng lượng phân tử 55,8 kDa – LLO thuộc họ độc tố gắn cholesterol hoạt nhóm thiol tạo chủ yếu vi khuẩn Gram dương Hoạt tính ly giải độc tố giảm thiểu số tác nhân bị kìm hãm oxy hóa biểu có cholesterol kháng thể kháng streptolysin O Cytolysin hoạt hóa thiol có cystein đơn vùng đầu C khiến cho chúng dễ bị bất hoạt oxy hóa cystein thay alanine mà khơng làm chức ly giải Chúng tạo thành lỗ khơng liên tục với đường kính bên lên đến 30 nm màng chứa cholesterol Phương châm hoạt động chúng dựa trên tương tác với cholesterol có GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 10 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella  Ðối chứng dương: thay dịch khuôn DNA mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết  Ðối chứng âm: thay dịch khuôn DNA mẫu nước cất vô trùng + Chương trình khuếch đại  Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: Duy trì nhiệt độ 95 oC phút để làm biến tính hồn tồn sợi DNA mẫu Kế đến 35 chu kỳ, chu kỳ có bước sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây 72oC/60 giây Sau chấm dứt 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72oC 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20 oC điện di – Ðiện di sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị gel điện di agarose 1%  Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di cần có độ dày khoảng – mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hoàn toàn đệm TAE + Chuẩn bị dịch điện di  Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật + Ðiện di  Một giếng gel điện di sử dụng cho thang DNA chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn – Nhuộm DNA, xem xét sản phẩm khuếch đại + Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu  Pha dung dịch nhuộm DNA sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di + Nhuộm gel  Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng – phút để loại bỏ phần etyl bromua dư + Xem xét, chụp ảnh  Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn xem xét vạch sáng đỏ DNA xuất gel Sau đó, chụp ảnh để lưu trữ kết GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 30 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Ðọc giải thích kết + Kết nghiên cứu cân nhắc tổng kết mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại DNA với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm khơng có sản phẩm + Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel + Mẫu tổng kết âm tính khơng có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích cỡ khác 520 bp 2.3.2.2 Mẹo ELISA – ELISA sử dụng rộng rãi dạng kit thương mại tôn tạo để Automation ELISA sử dụng để phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh Kĩ năng có độ nhạy khoảng 106CFU/ml nhiên phải thực bước tăng sinh tăng sinh chọn lựa trước thực phản ứng miễn dịch – Transia Salmonella (Diffchamb AB, Sweden) kit phát nhanh Salmonella spp dựa phép tắc E sanwich Khi hỗn hợp tăng sinh chọn lựa cho vô giếng, có diện vi con vật mục tiêu, kháng nguyên tiêm mao vi con vật tạo phức phù hợp với kháng thể cố định giếng kháng thể tự có gắn enzyme peroxydase tạo ra phức hợp kép (sanwhich) Sau kháng thể có gắn enzyme dạng tự không tạo phức hợp sanwhich bị rửa khỏi phản ứng Phức hợp sanwihch phát nhờ bổ sung chất phản ứng (ure peroxide teramethylbenzidine) Enzyme peroxide thủy phân chất tạo phản ứng màu xanh dương Phản ứng chấm dứt cách bất hoạt enzyme dung dịch chấm dứt làm acid hóa mơi trường lầm môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng Sự tạo dựng màu vàng minh chứng diện kháng nguyên hay vi con vật mục tiêu mật độ màu vi con vật xác nhận cách đo cường độ màu máy so màu 2.4 Các phương pháp kiểm tra Salmonella thực phẩm – So với gia súc gia cầm: Trong chăn ni cần ý dự phòng bệnh tật cho chúng Phải kiểm soát thú y giết súc vật, điều làm tốt có hội bán xuất loại thịt nhiễm Salmonella Trong giết thịt phải bảo đảm tính riêng lẻ, tránh lây lan vi khuẩn, ý tới loại công cụ dùng giết thịt GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 31 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Trong gìn giữ thực phẩm, bảo đảm thời gian giữ lại thực phẩm sơ chế nguyên liệu Lưu ý thịt băm, patê thịt nghiền mà không ướp lạnh sau tạo cơ hội cho tồn khối ngun liệu nhiễm trùng mau lẹ – Đun sôi thực phẩm trước ăn phương pháp tốt Thịt ướp lạnh thời gian đun nấu phải kéo dài bình bình, đun phải bảo đảm nhiệt độ sôi bên miếng thịt (khoảng 1 đến 2 phút) Thực phẩm thừa, thực phẩm dự phòng phải đun lại trước ăn Với trứng bị nhiễm Salmonella sớm đẻ (trứng vịt, ngan, ngỗng ), phải sơ chế chín hồn tồn, tuyệt đối khơng ăn sống hồng đào.Đảm bảo vệ sinh nơi ăn, tránh ruồi, nhặng, chuột – Thực nghiêm ngặt chính sách khám tuyển trước vào khám định kỳ (1 năm/1 lần) người tiếp xúc trực tiếp với thực phẩm thực phẩm hấp cho chín Chương III : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vị trí thời gian – Thời gian: Từ ngày 31/05/2010 đến ngày 12/06/2010 GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 32 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Vị trí thực hiện: Phòng thử nghiệm Khoa Môi trường Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM – Địa chỉ: 144/24 Điện Biên Phủ, P25, Q Bình Thạnh, TP Sài Gòn 3.2 Đối tượng phạm vi phân tích – Phân tích phát Salmonella số mẫu thịt gà tươi sống địa phận hai quận Phú Nhuận Bình Thạnh tp Sài Gòn 3.3 Nguyên liệu thử nghiệm 3.3.1 Các công cụ hóa chất tiến hành thử nghiệm – Kéo cắt mẫu – Pipet 1ml, 5ml, 10ml – Đĩa petri – Micropipet 10µl-200µl – Túi PE vơ trùng – Que cấy thẳng, que cấy vòng – Cân điện tử – Ống nghiệm khử trùng – Tủ ấm 37oC, 42oC – Nồi hấp khử trùng 121oC – Đèn cồn – Quả bóp cao su – Chai chịu nhiệt dung lượng 500ml, 1000ml – Gía ống nghiệm inox – Tủ cấy – Bông không thấm – Que cấy – Cồn 96o, 70o – Nước cất khử trùng 3.3.2 Các môi trường sử dụng – Môi trường BPW (Ấn Độ) – Môi trường RV (Ấn Độ) – Môi trường XLD (Ấn Độ) – Mơi trường dùng để check sinh hóa : + LDC (Ấn Độ) + Manitol (Ấn Độ) + Urea (Merck) + VP (Ấn Độ) + TSI (Ấn Độ) + Trypton (Ấn Độ) 3.4 Bài viết thực Mẫu thịt gà Thu mẫu vị trí thăm dò GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 33 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Nhận xét tiêu Cảm quan Salmonella 25 g mẫu + 225 ml BPW, đồng 30 giây Đánh giá,nhất Kếtmẫu luậntrong -1 Hình 3.1: Nội dungđộthực thử nghiệm pha lỗng 10 3.5 Mẹo phân tích 3.5.1 Quy trình nghiên cứu Đem ủ 37oC 24 Lấy 0.1ml canh trường cho vô môi trường RV Ủ 42oC ± 0,5 24 Cấy chuyển môi trường XLD ủ nhiệt độ 37 oC 24 KL đặc thù Salmonella mơi trường XLD : tròn, lồi, suốt, có tâm đen đơi tâm đen q lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xoay quang chuyển sang màu đỏ Cấy chuyển vào môi trường check sinh hóa : mơi trường TSI, Manitol phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP Hình 3.2: Quy trình nghiên cứu Salmonella thử nghiệm 3.5.2 Ủ 37oC 24 Thuyết minh quy trình GVHD: KS Huỳnh Văn Thành 34 SVTH: Nguyễn HữuBiểu Liêmhiện đặc thù Salmonella : TSI: đỏ/vàng/H2S(+)/gas(+)/; Manitol(+); Urea(-); LDC(+); Indol(-); VP(-) Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella a) Chuẩn bị mẫu – Dùng kéo vô khuẩn cắt 25g mẫu (không lấy mỡ, lấy chất lỏng có), cho vô bao nilong vơ khuẩn Thêm vào 225ml môi trường PBW hấp khử trùng để nguội Tiến hành đồng mẫu độ pha loãng 10 -1 Đem ủ nhiệt độ 370C 24 b) Cấy mẫu – Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml mơi trường tăng sinh chọn lựa RV, Ủ 42 ± 0,5 oC 24 – Phân lập: Cấy mẫu từ môi trường RV sang môi trường thạch đĩa XLD ủ nhiệt độ 370C 24 Nhận dạng khuẩn lạc đặc thù salmonella mơi trường XLD: tròn, lồi, suốt , có tâm đen đơi tâm đen q lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xoay quang chuyển sang màu đỏ (hồng)… Hình 3.3: Khuẩn lạc đặc thù Salmonella – Chọn khuẩn lạc đặc thù cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lựa ủ 37 ± 0,5oC 24 c) Thực nghiệm cam đoan – Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang môi trường thực nghiệm sinh hóa Thực sau:  Thử nghiệm môi trường TSI: – Hấp khử trùng môi trường TSI 1210C 15 phút cung cấp môi trường vào ống vô trùng để làm ống thạch nghiêng GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 35 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Dùng que cấy vòng cấy sinh khối từ khuẩn lạc giống sâu vào đáy ống thạch nghiêng – Sau cấy xong ủ 370C vòng 24h – 48h – Salmonella lên men đường glucose môi trường TSI  phần nghiêng môi trường TSI có màu đỏ, phần sâu có màu vàng – Salmonella có khả H2S  xuất vệt màu đen mơi trường TSI – Có thể thấy tượng sinh qua tượng làm vỡ thạch môi trường môi trường bị đẩy lên tạo khoảng trống bên ống nghiệm Negative Negative Positive Hình 3.4: Thực nghiệm mơi trường thạch TSI  Thử nghiệm Urea Broth: – Cấy VSV vào mơi trường canh urea có chứa chất thị bromocresol purple – Ủ 370C khoảng 12h – 18h – Thực nghiệm (+): môi trường chuyển sang màu vàng – Thực nghiệm (-): môi trường không đổi màu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 36 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella  Salmonella không phân giải urea nên không làm biến đổi pH môi trường Sau nuôi cấy môi trường giữ ngun màu tím Negative Negative Negative Hình 3.5: Thực nghiệm Urea Broth  Lên men mannitol: – Môi trường sử dụng mơi trường phenol red broth base có pH 7.4, thị mơi trường phenol red có màu đỏ chuyển thành màu vàng pH < 6.8 – Tiến hành cấy vào ống môi trường chủng VSV cần cam đoan – Ủ 370C 18 – 24h – Khả lên men chủng nhận xét dựa trên sinh acid sinh – Sinh acid (+): môi trường màu cam chuyển sang vàng – Sinh (-): có bọt khí ống Durnham  Môi trường sau nuôi cấy salmonella bị acid hóa chuyển thành màu vàng GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 37 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Negative Positive Negative Hình 3.6: Lên men Mannitol  Thử nghiệm LDC (Lysine Decarboxylase): – Sử dụng môi trường Falkow – Tiến hành cấy vào ống môi trường chủng VSV cần cam đoan – Chất thị màu môi trường Bromocresol purple – Phản ứng (+): môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục – Phản ứng (-): mơi trường từ tím chuyển sang vàng  Sau nuôi cấy salmanella môi trường chuyển thành kiềm, môi trường giữ nguyên màu tím ban đầu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 38 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Negative Hình 3.7: Thực nghiệm LDC  Thử nghiệm khả sinh Indol: – Cấy VSV thực nghiệm qua môi trường canh trypton ủ khoảng 24 37oC – Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên mặt phẳng môi trường, thêm vài giọt thuốc thử Kovac’s – Xem xét sau ít phút – Thực nghiệm (+): mặt phẳng môi trường xuất vòng màu đỏ cánh sen – Thực nghiệm (-): khơng xuất vòng đỏ GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 39 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Positive Negative Negative Hình 3.8: Thực nghiệm Indol  Thử nghiệm Voges – Proskauer: – Cấy vi con vật vào môi trường glucose phosphate (MR-VP Broth) – Ủ nhiệt độ 370C vòng từ 2-5 ngày – Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuốc thử anpha- naphtol 5% cồn dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 % với tỷ lệ 3:1 – Xem xét phản ứng xảy phút – Thực nghiệm (+):xuất màu đỏ hay hồng sáng mặt môi trường – Thực nghiệm (-): môi trường không đổi màu GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 40 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Negative Hình 3.9: Thực nghiệm Voges – Proskauer 3.4.5 Nhận định tính sinh hố đặc hiệu: Thuộc tính sinh hố Dương âm tính Tỷ lệ % với vi khuẩn Salmonella TSI lactose 99,2 TSI sucrose 99,5 TSI glucose + 100 TSI glucose sinh + 91,2 TSI hydro-sulfua + 91,6 Phân giải urê 100,0 Lên men mannitol + Phản ứng Indol 98,2 Phản ứng V.P 100,0 Bảng 3.1: Phát hay không phát Salmonella 25g mẫu 3.6 Kết 3.6.1 Kết cảm quan – Về màu sắc, thịt gà có màu đặc thù, phần thịt hồng, phần mỡ màu vàng tươi da màu vàng trắng – Về mùi, thịt có mùi đặc thù, khơng có mùi lạ – Về thuộc tính, mặt phẳng thịt có nước, có độ bọn hồi tốt – Về cảm quan nhìn chung tốt, thịt nhìn tươi, thuộc tính, màu sắc, hương vị khơng có lạ Nhưng nhận xét cảm quan không đủ để cân nhắc mức độ thịt 3.6.2 Kết nhận xét mức độ nhiễm Salmonella – Nhận xét theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức độ nhiễm Salmonella CFU/25g GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 41 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Hình 3.10 : Tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu thăm dò – Theo bảng trên, mẫu mẫu nhiễm Salmonella với tỷ lệ 33.33% Việc tạp nhiễm Salmonella thao tác người cung cấp thịt không hợp vệ sinh, không dùng công cụ bảo lãnh Hoặc thịt bị tạp nhiễm khơng khí, vệ sinh khu bn bán nhiễm trọng tâm giết mổ Hai mẫu nhiễm nói lên thực trạng vệ sinh an toàn thực phẩm hai khu vực thấp, tỷ lệ tạp nhiễm quy định TCVN CFU/25g – Tóm lại, ba mẫu 1, âm tính với Salmonella sử dụng được, phải bảo đảm vệ sinh an tồn thực phẩm, khơng có Salmonella gây ca ngộ độc thực phẩm cực kỳ nghiêm trọng, không nhiễm Salmonella khơng có nghĩa khơng nhiễm vi con vật khác – Hai mẫu sử dụng được, sở cung cấp cần phải có phương pháp vệ sinh tốt hơn, đổi khu vực lấy thực phẩm khác để tránh thực trạng lây nhiễm Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Tổng kết – Sau trình phân tích lý thuyết thử nghiệm, chúng tơi nhận ra Salmonella lồi vi khuẩn bất trắc, chúng gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết số bệnh khác Đáng nói loài thường tạp nhiễm vào thực phẩm, điều vơ bất trắc theo TCVN, mức độ nhiễm Salmonella CFU/25 g GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 42 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella – Mạng lưới kiểm soát an toàn vệ sinh thực phẩm trải rộng khắp nước, lực kiểm dịch chưa cao bản địa , tp lớn Thành phố Sài Gòn 4.2 Kiến nghị – Trong thử nghiệm trên, có số phần thời gian gấp mà chưa thể thực + Thăm dò thực trạng vi sinh khu bn bán + Thăm dò qua tình hình giết mổ gia cầm địa phận tp Sài Gòn – Lập trọng tâm kiểm dịch địa phận quận yêu cầu thịt trước bán cần phải qua kiểm dịch sử dụng công cụ phân kết hợp vệ sinh – Nên lập vị trí bán thực phẩm chăm chú để đơn giản kiểm soát vệ sinh khu bán buôn Thường xuyên tổ chức đợt kiểm soát khu chăn nuôi giết mổ để bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ môn vi con vật trường đại học y Hà Nội (2007), vi con vật y học, Nxb y học, Hà Nội Bộ môn vi con vật trường đại học y khoa Huế (2004), giảng vi sinh y học Bộ y tế (2008), vi con vật y học, Nxb y học, Hà Nội Trần Linh Phước (2009), bí quyết nghiên cứu vi con vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục, Hà Nội TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Bibek Ray (2009), FUNDAMENTAL FOOD MICROBIOLOGY, ,Boca Raton London New York Washington, D.C, USA Camilla Giammarini and Mauro Magnani, Listeriolysin O from Listeria monocytogenes, Diatheva, Centre for Biotechnology, University of Urbino, Italy GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 43 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella Cynthia L.Sears and James B.Kaper (1996), Enteric Bacterial Toxins: Mechanisms of Action and Linkage to Intestinal Secretion, American Society for Microbiology FAO and WHO (2009), Salmonella and Campylobacter in chicken meat Jame M.Jay (2000), Modern Food Microbiology 10 WHO, Risk assessments of Salmonella in eggs and broiler chickens GVHD: KS Huỳnh Văn Thành SVTH: Nguyễn Hữu Liêm 44 … Tìm tòi vi khuẩn Salmonella thường có biểu hiện ly bì, mê man, trụy tim mạch, không chữa trị kịp thời kéo theo từ trần Những di chứng khác vi m phổi cấp,, vi m màng não, vi m gan, vi m tủy xương… Liêm 15 Khóa luận: Tìm tòi vi khuẩn Salmonella nguyên vỏ bao bọc bên kháng nguyên O, khánh ngun Vi khơng gia nhập vào q trình gây bệnh 2.2.5 Yếu tố độc lực – Vi khuẩn Salmonella tiết loại độc tố:… hiểu vi khuẩn Salmonella khả nhân lên đại thực bào nội độc tố Kháng nguyên Vi có mặt S.typhi S.pararatyphi C yếu tố độc lực trọng yếu, chủng vi khuẩn gây bệnh thương hàn khơng có kháng ngun Vi

Xem Thêm  [Update] Cua Biển Ăn Gì Để Sống ? Kỹ Thuật Nuôi Cua Biển Bằng Thức Ăn Công Nghiệp – Thdcanada.com.vn | cua con ăn gì để sống - Xác minh

– Tìm hiểu thêm –

Tìm hiểu thêm: TIM HIEU VE VI KHUAN SALMONELLA , TIM HIEU VE VI KHUAN SALMONELLA

By ads_law

Trả lời